Kuopion kampuksella sijaitseva mikroskopian laboratorio pohjautuu jo 1970-luvulla perustetun Elektronimikroskopian laitoksen toimintaan. Laboratoriolla onkin merkittävä asema alueellisesti nimenomaan erikoismikroskopian ja kuvantavan spektroskopian alalla, mukaan lukien vaativat näytteenvalmistuksen erityistekniikat etenkin biologisten näytteiden osalta.
Kovakudoslaboratoriossa, missä tuotetaan maksullisia palveluja myös yliopiston ulkopuolisille asiakkaille, voidaan prosessoida esimerkiksi metallisen implantin sisältäviä biologisia kudoksia tai suuria luunäytteitä valomikroskooppista tarkastelua varten.
SIB Labs elektronimikroskopian laboratorio on osa Biocenter Finland ja Biokeskus Kuopio –kuvantamiskeskuksia.
SIB Labs elektronimikroskopian laboratorio on myös osa Finnish Advanced Microscopy Node (FiAM) of Euro-BioImaging Finland -kokonaisuutta.
Laboratoriopalvelut ja infrastruktuuri
Laboratoriossa on ajanmukainen läpäisyelektronimikroskooppi (TEM) niin biologisten kuin materiaalitieteenkin näytteiden tarkasteluun jopa atomitason erotuskyvyllä. Muun muassa Kuopion yliopistollisen sairaalan kliininen diagnostiikka tukeutuu laitteistoomme tältä osin. TEM soveltuu esimerkiksi biologisten solu-, kudos- tai kasvinäytteiden, sekä virusten tai vesikkelien analyysiin. Materiaalitutkimuksessa näytteinä ovat mm. nanopartikkelit, pinnoitteet ja prosessoidut ohutleikkeet. Tavallisessa TEM-työskentelyssä suurennos 50x - 1 500 000x. Laitteen erotuskyky < 0,2 nm. Laitteessa on STEM-moodi ja EDS-analysaattori alkuainejakauman määrittämiseen ja SAED kideanalyyseihin.
Korkean resoluution pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) voidaan tarkastella näytteiden pintarakenteita suurella erotuskyvyllä sekä määrittää näytteen alkuainejakaumia. Laite soveltuu näytteiden pintarakenteen monipuoliseen tarkasteluun modernien detektorien ansiosta (SE, In-lens, BSE, STEM, VP). Lisäksi laitteessa on kaksi EDS-detektoria alkuaineiden nopeaan määritykseen biologisistakin näytteistä. Läpäisymoodissa onnistuu myös ultraohuiden leikkeiden tarkastelu sekä sähköä johtamattomien näytteiden tarkastelu säädeltävän tyhjiön kaasunpaineen avulla (Variable Pressure, VP). Pintarakenteiden 3D-mallin muodostaminen onnistuu erityisellä ohjelmistolla. Laitteella saavutettava erotuskyky on parhaimmillaan noin 1,0 nm.
Tarkemmat kuvaukset mikroskopian palveluista ja laitteista löydät alta.
Mikroskopia
Mikroskopian laboratoriossa on mm. ajanmukainen, vuonna 2010 hankittu korkean resoluution läpäisyelektronimikroskooppi (TEM), jolla voidaan tarkastella niin biologisia kuin materiaalitieteenkin näytteitä jopa atomitason erotuskyvyllä. Muun muassa Kuopion yliopistollisen sairaalan kliininen diagnostiikka tukeutuu laitteistoomme tältä osin. TEM soveltuu esimerkiksi biologisten solu-, kudos- tai kasvinäytteiden, sekä virusten tai vesikkelien analyysiin. Materiaalitutkimuksessa näytteinä ovat mm. nanopartikkelit, pinnoitteet ja prosessoidut ohutleikkeet.
Korkean resoluution pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (SEM) voidaan tarkastella näytteiden pintarakenteita suurella erotuskyvyllä sekä määrittää näytteen alkuainejakaumia. Laite soveltuu näytteiden pintarakenteen monipuoliseen tarkasteluun modernien detektorien ansiosta (SE, In-lens, BSE, STEM, VP). Lisäksi laitteessa on kaksi EDS-detektoria alkuaineiden nopeaan määritykseen biologisistakin näytteistä. Läpäisymoodissa onnistuu myös ultraohuiden leikkeiden tarkastelu sekä sähköä johtamattomien näytteiden tarkastelu säädeltävän tyhjiön kaasunpaineen avulla (Variable Pressure, VP). Pintarakenteiden 3D-mallin muodostaminen onnistuu erityisellä ohjelmistolla.
Läpäisyelektronimikroskooppi (TEM)
- Malli JEM-2100F (Jeol Co, Tokyo, Japan)
- Kiihdytysjännite 200kV (kenttäemissiotykki)
- Käytettävät suurennokset 50 - 1 500 000 X (läpäisymoodi)
- Resoluutio < 0.2 nm
- Muuta: Pyyhkäisy-läpäisy -moodi (Scanning-transmission)
- Digitaalinen kamera Quemesa 11 MPix (Olympus-SIS, Münster, Germany)
- Alkuainenalysaattori (EDS) Thermo 20 mm2 EDS LN2-jäähdytetty SiLi-detektori (ThermoFisher, Waltham, USA)
- Näytteenpitimet: rutiini (1-näytteen), moninäytepidin (3-näytettä), tomografia
Pyyhkäisyelektronimikroskooppi (SEM)
- Malli SIGMA-HD|VP (Carl Zeiss NTS, Cambridge, UK)
- Kiihdytysjännite 0.02 – 30 kV (kenttäemissiotykki)
- Käytettävät suurennokset 30 - 500 000 X
- Resoluutio < 2 nm
- Muuta: läpäisymoodi TEM-näytteille (Scanning-transmission)
- SE2, InLensSE, VP-SE, BSE, Stereokuvaus 3D
- 2 kpl Alkuainenalysaattori (EDS): Thermo 60 mm2 EDS SDD-detektorein (ThermoFisher, Waltham, USA)
- Näytteenpitimet: rutiinikuvauksiin 9-näytteen karuselli, karuselli 1” suodattimille (5-näytettä), 12 TEM-hilan pidin, sekä ”ruuvipenkki”
Motorisoitu valomikroskooppi
- Carl Zeiss AxioImager M2 + värikamera Axiocam MRc
- 1.25x, 2.5x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x, 100x objektiivit
- Fluoresenssivarustus (UV, FITC, GFP ja Rhodamine)
- Pintavalovarustus heijastaville näytteille
- Polarisaatiovarustus
- Motorisoitu näytepöytä mahdollistaa esim. suurten näytteiden kuvauksen ("mosaiikkikuvaus") tai heijastavien näytteiden pinnankarheuden määrittämisen.
Käänteismikroskooppi
-
Nikon TE-300; Tällä hetkellä ei digikameraa asennettuna.
Valomikroskooppi
- Nikon Microphot FXA + Hamamatsu ORCA b/w-kamera
- Mm. DIC- ja faasikontrastioptiikalla varustettu laitteisto. Optimoitu tällä hetkellä densitometria-käyttöön.
Laboratoriomikroskooppi
- Zeiss Primo Star + AxioCam ERc 5s värikamera (laboratoriokäyttöön)
- Objektiivit 4x, 10x, 40x ja 100x (oil)
Stereomikroskooppeja
- Carl Zeiss, Leica; pintojen tarkasteluun suuristakin näytteistä
- Leica MZ75 + digitaalikamera Nikon DS-Fi2 ja ohjausyksikkö DS-L3
- Zeiss Stemi DV4
- Leica EZ4; sisäänrakennettu värikamera
Pintaplasmoniresonanssi-spektrometri
- Biacore X; biomolekyylien sitoutumisen tutkintaan
Alkuaineanalyysi
- Energiadispersiivisen röntgenspektroskopia (EDS) -laitteen avulla elektronimikroskoopilla voidaan tutkia näytteen pinnan alkuainekoostumusta.
- Olemme SIB Labsilla kehittäneet EM-laitteistoamme ja analyysimenetelmiä erityisesti biologisia näytteitä varten.
Tomografia
- TEM:llä on mahdollista tehdä elektronitomografia (ET) -kuvauksia. Elektronitomografian avulla voi saada 3D-kuvaa lähes nanometrimittakaavassa.
- Näytepidintä järjestelmällisesti kallistamalla tallennetaan kuvasarja, josta lasketaan 3D tomogrammi.
- Kuvausohjelmistona on SerialEM ja kuvalaskentaan voi käyttää IMOD-ohjelmistoa.
Pintarakenteet
- Tyypillisesti SEM-näytteiden pitää olla kuivia ja sähkönjohtavia.
- Biologisista näytteistä poistetaan vesi (dehydrointi), tehdään fiksaatio, ja päällystetään ohuella metallikerroksella. Pienet näytteet dehydroidaan kemiallisesti alkoholilla nousevassa konsentraatiosarjassa, suuremmille näytteille voidaan käyttää kriittisen pisteen kuivauslaitetta. Molemmissa tapauksissa näytteen vesi korvataan liuottimella, jolla on pienempi pintajännitys. Silloin näytteen rakenne pysyy helpommin ehjänä.
- SEM-laitteemme Zeiss Sigma HD|VP resoluutio on parhaimmillaan noin 1 nm.
- Sähköä johtamattomia näytteitä voidaan kuvata ns. muuttuvapaineisen käyttötilan avulla.
Pintojen 3D
- Perinteisen sekundäärielektronikuvauksen (SE) lisäksi näytteiden pintojen 3D-rakenne voidaan rekonstruoida takaisinsironneista elektroneista kerätystä datasta 4-sektorisen BSE-detektorin avulla. Parhaimmillaan datasta voidaan määrittää esimerkiksi pinnankarheus tai muita volumetrisia parametreja.
Alkuaineanalyysi
- Näytteen sisältämät alkuaineet voidaan määrittää samalla kun tehdään tavallista SEM-kuvausta käyttäen SEM:iin liitettyä EDS-detektoria (energy-dispersive spectrometer).
- Alkuaineiden jakautumisen analysointi on erittäin käyttökelpoinen analysoitaessa esimerkiksi näytteen kontaminaatioita tai homogeenisuutta. Kuitenkin on muistettava, että EDS-data kerätään näytteen koostumuksesta riippuen noin 1-2 mikrometrin paksuisesta pintakerroksesta.
Pyyhkäisyläpäisy -moodi
- TEM-hilat voidaan kuvata ja analysoida myös SEM:llä! Eli jos olet kiinnostunut solurakenteista pienillä suurennoksilla ja SEM tuntuu tutummalta työvälineeltä kuin TEM, voit käyttää myös SEM:ä ohutleikkeiden läpäisykuvaukseen.
Korrelatiivinen mikroskopia (CLEM)
- Yhteistyössä Akatemiatutkija Kirsi Rillan kanssa (Biolääketiede) olemme kehittäneet yksinkertaisen protokollan maljalla kasvatettujen solujen tutkimiseksi. Ensin tutkitaan soluja elävinä konfokaalimikroskoopilla ja sen jälkeen samat solut tarkastellaan SEM:llä.
Näytteenvalmistus
Elektronimikroskopian näytteenvalmistuksessa näytteet prosessoidaan asiakkaiden (tutkijat tai yritykset) kanssa sovittujen protokollien mukaisesti valmistaen ultraohuet (noin 70 nanometriä) leikkeet TEM-tarkastelua varten, tai esimerkiksi kuivatut ja kullalla pinnoitetut näytteet SEM-tarkastelua varten. Ionipommitukseen perustuvat laitteistot soveltuvat mm. monikerrosrakenteiden tai farmaseuttisten näytteiden poikkileikkeiden valmistukseen VM-, SEM- ja TEM-kuvausta varten.
Näytteenvalmistuslaitteisto
-
Leica Ultracut UC; Ultramikrotomi
-
Reichert-Jung Ultracut E; Ultramikrotomi. Lisälaitteet Cryo-laite (FC 4E; Reichert-Jung, Itävalta) ja Cryo-fiksaatiolaite (KF 80; Reichert-Jung, Itävalta)
-
Reichert-Jung Lynx EM Tissue Processor; Kudosautomaatti EM-näytteille
-
Reichert-Jung Ultratrim; Trimmauslaite
-
Leica Ultrostainer; Värjäysautomaatti
-
Reichert AFS; Jäädytyskorvauslaite
-
Quorum Technologies K850; Kriittisen pisteen kuivauslaite
-
Leica EM RES102; ionipommituslaite EM-näytteiden prosessointiin ionipommituksen avulla
-
Leica EM TXP; EM-näytteiden esikäsittelyyn sahaamalla ja hiomalla mikrotasolla
-
Leica EM ACE600; EM-näytteiden sähkönjohtavuuden viimeistelyyn
-
Agar Scientific Automatic Sputter Coater B7341; Päällystyslaite
-
LKB Knife Maker 7801 B; Veitsentekolaite
-
ZEISS Primo Star valomikroskooppi kameralla varustettuna
Muoviin petaus ja ohutleikkaus
Tavallinen TEM-näytteen valmistus sisältää fiksoimisen esim. 2-2,5 % glutaraldehydillä 0,1 M fosfaattipuskurissa, jälkifiksoimisen osmiumtetroksidilla, vedenpoiston nousevassa alkoholikonsentraatiosarjassa, sekä valun muovihartsiin (Epon).
Ultramikrotomilla valmistetaan ultraohuita (noin 70 nm) leikkeitä, jotka värjätään uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla.
Jäädytyskorvaus -menetelmät (Freeze-Substitution)
Kun tavoitteena on välttää kemiallisen fiksoimisen aiheuttamia artefaktoja, voidaan näyte kiinnittää nopeasti jäädyttämällä. Jäädyttämisen jälkeen näytteen sisältämä vesi korvataan alhaisessa lämpötilassa (alle -70°C) orgaanisella liuottimella ja valetaan muoviin tai prosessoidaan immuno-elektronimikroskopiaa varten.
Negatiivivärjäys
Negatiivivärjäystä käytetään tyypillisesti esim. eristettyjen organellien, partikkelien tai virusten tutkimisessa.
- Pieni pisara biologista mikro-organismia inkuboidaan hiilipäällysteisellä ja hohtopurkauskäsitellyllä TEM-hilalla.
- Ylimääräinen näyte poistetaan huuhtomalla.
- Näytteen kontrastia vahvistetaan raskaita alkuaineita sisältävällä suolalla, esim. uranyyliasetaatilla.
- Myös immunovärjäys soveltuu käytettäväksi tällaisille näytteille.
Suomen ainoassa maksullisia palveluja tuottavassa kovakudoslaboratoriossa voidaan prosessoida esimerkiksi biologisia kudoksia, jotka sisältävät metallisen implantin. Myös suuret luunäytteet voidaan leikata valomikroskooppista tarkastelua varten.
Kovakudosmenetelmistä hyötyvät bio-, terveys- ja materiaalitekniikan yritykset. Sovellukset liittyvät esimerkiksi biopsioihin ja implantteihin, hammastutkimuksiin, verisuonten tukistentteihin, elektroniikan monikerrosrakenteisiin tai materiaalien pintakäsittelyyn. Lisäarvoa laadunvalvontaansa kovakudosmenetelmistä saavat myös esimerkiksi puualojen ja metsäteollisuuden yritykset.
Näytteenvalmistuslaitteisto
- Macro Exakt 310 CP: timanttiterällä varustettu makrosahauslaitteisto kovien materiaalien hallittuun sahaamiseen. Laitteistossa on tarkkuusohjaus ja automaattinen kohdistus. Esimerkiksi muoviin pedatun ja implantin sisältävän kudoksen leikkaus.
- Exakt 400 CS: mikrohiontalaitteisto. Esimerkiksi sahattujen näytteiden hallittuun ohentamiseen valomikroskooppista analyysia varten, tai materiaalitutkimuksen näytteiden viimeisteltyyn hiontaan. Laitteistossa on AW 110 lisälaite poistettavan paksuuden mittaukseen mikrometritasolla sekä 40 CS lisälaite hiontalevyn ohjaukseen.
Pienlaitteistot näytteiden prosessointiin, Exakt-kokonaisuus:
- Kudoskäsittelylaite Exakt 510 dehydraatio- ja infiltraatiojärjestelmällä. Kuivatus alkoholilla ja imeytys muoviin.
- Exakt 520 valopolymerisointilaite, jossa nestemäinen muovi kovetetaan valon avulla.
- Exakt 530 jälkikäsittelylaite, jossa on lämpölevy, valo, vakuumi ja lisäpolymerisointi tarvittaessa.
- Exakt 401 liimapuristin näyteblokin kiinnittämiseen aluslasille.
- Exakt 402 tarkkuusliimapuristin leikelasin kiinnittämiseen hiotun ja kiillotetun näyteblokin päälle.
Lisäksi kovakudoslaboratoriossa on
- Reichert-Jung Polycut S kovakudosmikrotomi luu- ja rustonäytteiden ohutleikkaukseen.
- Leica MZ 7-5 stereomikroskooppi ja Nikon Digital Sight DS-Fi2 -kamera.
Sahaus-hionta
Soveltuu implantteja sisältäville kudosnäytteille, hampaille ja muille koville näytteille. Näytteet valetaan EXAKT Technovit 7200 VCL –muoviin. Valomikroskooppista analyysia varten valmistetaan jopa 20 mikrometrin ohuthieleikkeitä. SEM-näytteiden esikäsittely voidaan tehdä esimerkiksi sahaamalla ja hiomalla.
Kovakudosmikrotomi
Soveltuu mm. luu- ja rustonäytteille. Näytteet valetaan metyylimetakrylaattimuoviin, jolloin luun morfologia säilyy. Valomikroskooppista analyysia varten valmistetaan jopa 3 mikrometrin leikkeitä. IR-mikroskopiaan voidaan valmistaa esimerkiksi 3-5 mikrometrin leikkeitä.
